Šiandien yra sukurtos metodikos, kurios padeda tiesiogiai nustatyti, ar yra viruso organizme arba netiesiogiai nustatyti žmogaus imuninį atsaką į virusą.

Dabartiniu metu ŽIV virusą galima nustatyti netiesioginiais ir tiesioginiais metodais.

Netiesioginiai tyrimo metodai:

• Antikūnų prieš ŽIV nustatymas serume( ELISA)

• Antikūn prieš ŽIV nustatymo pagrindimas Western Blot testu

Tiesioginiai tyrimo metodai:

• p24 antigeno nustatymas

• ŽIV izoliavimas ląstelių kultūroje

• ŽIV nukleorūgščių išskyrimas PGR metodu

• ŽIV genotipinių ir fenotipinių savybių nustatymas

Įprasta, kad iš karto daromi tyrimai ŽIV-1 ir ŽIV-2 nustatyti, kai pacientas tiriamas pirmą kartą. ELISA Tyrimas paremtas antikūnų prieš ŽIV virusą nustatymas tiriamojo asmens kraujo serume. Iš pradžių buvo vartojami užkrėsti ŽIV ląstelių lizatai. Dabartiniu metu kaip antigenai naudojami virusų labai gerai išvalyti rekombinantiniai baltymų paptidai. Taip gauti antigebai yra daug specifiškesni, tačiau šiek tiek riboja ŽIV-1 potipių nustatymą.

Antikūnai, kurie nustatomi tiriamo žmogaus kraujo serumu, paprastai priklauso IgG klasei. Viruso antigeno ir antikūnų sąveika vertinama atsižvelgiant į spalvos pokytį.Jo esmė: specifiški antikūnai reaguodami su ŽIV antigenais, sudaro kompleksą, kurį nusako spalvinė reakcija su peroksidaze.

ELISA tyrimo rezultatai kartais gali būti tariamai teigiami, todėl jo rezultatai visada grindžiami Western Blot metodu

Western Blot metodas

Western bloto (WB) tyrimas teikia daugiau informacijos negu imunofermentiniai atrankiniai testai. WB tyrimo esmė ta, kad reakcijoje panaudojami ŽIV proteinai, atskirai imobilizuoti ant nitroceliuliozinės juostelės. Dėl to šis būdas leidžia diferencijuoti, būtent su kokiu baltymu reagavę antikūnai yra atsakingi už atrankinio imunofermentinio testo rezultatą. ŽIV kultūros lizatas iš dalies yra apvalomas ir baltymai poliakrilamidiniame gelyje yra frakcionuojami pagal molekulinį svorį. Mažesni, tai yra turintys mažesnį molekulinį svorį proteinai, elektroforetiniame lauke nukeliauja per gelį žymiai toliau negu didelio molekulinio svorio proteinai, kurie pasilieka gelio pradžioje. Taip išdėstyti baltymai po to pastovia srove yra perkeliami iš gelio ant nitroceliuliozinio pagrindo. Žmogaus antikūnai ŽIV proteinams, jei tokių yra tiriamajame serume, susiriša su atitinkamais viruso antigenais. Plovimu pašalinus nesusirišusias medžiagas, nitroceliuliozinės juostelės yra inkubuojamos konjugatu – antikūnais prieš žmogaus IgG klasės antikūnus, žymėtus fermentu (peroksidaze, šarmine fosfataze arba kitu). Paskutiniu reakcijos etapu, pridėjus bespalvio substrato, pagal molekulinį svorį išdėstyti celiuliozinėje juostelėje baltymai vizualizuojami ten, kur įvyksta antikūnų ir konjugato sąveika. Antikūnų ir baltymų pozicijos palyginimas ir identifikacija vykdoma pagal žinomo standartinio serumo, kuris reaguoja su visais ŽIV proteinais, reakcijos vaizdu. Interpretuojant reakcijos rezultatus dažniausiai naudojamasi gag, pol ir env viruso genų produktais (1 lentelė)

1 lentelė

ŽIV-1 ir ŽIV-2 genų produkuojami baltymai, naudojami serologinei diagnozei patvirtinti

Antikūnai prieš funkcinių ŽIV genų tat, vif, nef produktus yra aptinkami žymiai rečiau ir tvirtinant reaktyvių serumų rezultatus dažniausiai nenaudojami. Nors WB tyrimo tikslas yra nustatyti gauto tiriant atrankiniais testais teigiamo rezultato specifiškumą, atliekant jį taip pat gali būti gaunami nespecifiniai rezultatai. Pagrindinė priežastis ta, kad virusas dauginamas limfocitų kultūrose, kurios išskirtos iš žmogaus. Dėl to gavus neaiškų rezultatą tiriant WB, kai antikūnų, reaguojančių su viruso baltymais, neužtenka serologinei diagnozei patvirtinti, tenka tyrimą pakartoti, tikintis antikūnų dinamikos.

Anksčiau serologinės ŽIV diagnozės atmetimas, atrodo, buvo aiškus, esant neigiamam rezultatui visiems viruso baltymams, tiriant WB. Tačiau imunofermentinių atrankinių diagnostinių rinkinių tobulinimas, didinant jų jautrumą, dabar lemia, kad gaunami silpnai teigiami rezultatai tiriant III generacijos sistemomis negali būti pripažinti seronegatyviais net jei WB reakcija neigiama. Šiais atvejais reikia pildomų tiesioginių ŽIV antigeno, molekulinių provirusinės DNR, virusologinių tyrimų diagnozei patvirtinti.

Tiesioginiai tyrimo metodai

p24 antigeno nustatymas

Užsikrėtus ŽIV infekcija, paciento kraujyje gali būti laisvų viruso baltymų ir dalelių. Taikant ELISA metodą, galima rasti p24 antigeną ir patvirtinti, kad žmogus užsikrėtė. Šis antigenas gali cirkuliuoti kraujyje, susijungęs su baltymu, todėl atskyrus jį nuo pastorojo, galima gauti tikslesnį atsakymą. Reakciją patcirtina neutralizuojantis specifinis metodas, atnešdamas galimus tariamai teigiamus rezultatus. p24 antigeną galima nustatyti praėjus ne mažiau kaip 5 ar 20 dienų po užsikrėtimo. Jis visada būna pirminio užsikrėtimo metu.

Antigeno detekcijos trūkumai yra nedidelis jautrumas (10-30 pg/ml) ir laisvo – nesurišto su antikūnais į kompleksus antigeno aptikimas. Dėl šių priežasčių seroreaktyvūs asmenys, kurių WB ir antigeno reakcijos neigiamos, tiriami paudojant molekulinę diagnostiką.

PGR Vienas iš jos metodų - polimerazės grandininės reakcijos procesas buvo išvystytas DNR grandžių padauginimui in vitro. Visų pirma iš periferinio kraujo mononuklearinių ląstelių yra išskiriama DNR, kuri tiriama reakcijos metu. Polimerazės grandininė reakcija - pasikartojantis procesas, kurį sudaro trys skirtingi etapai: 1) DNR denatūravimas (dviejų grandžių DNR išskiriama ir paverčiama vienos grandinės), 2) praimerių prijungimas (vyksta oligonukleotidų praimerių hibridizacija), 3) naujų DNR grandinių sintezė (termostabili DNR polimerazė sintezuoja naujas grandines DNR, kurios yra komplementarios oponuojantiems prisijungusiems praimeriams). Šių trijų ciklų pasikartojimų metu (dažniausiai 30-40 ciklų) iš vienos specifinės sekos gali būti sintezuota 1 mln jų kopijų, kurios gali būti aptiktos įprastais, sąlygiškai nesudėtingais metodais, tokiais kaip elektroforezė ar imunofermentinė reakcija. Nepaisant, atrodytų, didelio reakcijos tikslumo, kurį garantuoja DNR komplementariškumas, sintezuojantys fermentai taip pat daro klaidas. Dėl šios priežasties galutinis sprendimas priimamas tik atlikus reakcijos produkto hibridizacijos reakciją.

Per didelis polimerazės grandininės reakcijos tikslumas sukelia ir papildomų problemų. ŽIV vienas iš labiausiai mutuojančių virusų, todėl įmanoma gauti netikrą neigiamą reakciją, jei mutacija įvyko būtent ieškomame ŽIV provirusinės DNR sekoje.

Virusologinis metodas padeda išspręsti šias problemas. Atliekant šį tyrimą, periferinio kraujo mononuklearinės ląstelės iš neinfekuoto donoro yra paveikiamos fitohemagliutininu, kad atsirastų aktyvuotų limfoblastų, kurie yra ŽIV išskyrimo tikslinės ląstelės. Pridedama įtariamo ŽIV infekcija asmens mononuklearų santykiu 1:1. Gautas ląstelių mišinys kultivuojamas ir monitoruojamas dėl ŽIV viruso replikacijos. Pagrindiniai metodai tai atlikti - ŽIV antigeno aptikimas supernatante, citopatinis efektas ląstelėse, ŽIV specifinių grandžių nustatymas molekuliniais amplifikacijos metodais, atvirkštinės transkriptazės aktyvumo nustatymas ląstelių kultūroje. Kadangi testo jautrumas priklauso nuo naudojamų ląstelių linijų bei taikomo detekcijos metodo, virusologinio metodo jautrumas iš pozityvių asmenų yra 65-100 %. Nepaisant to, vienintelis būdas patvirtinti ŽIV infekcijos ar AIDS diagnozę seroneigiamų asmenims, kurių kraujyje neįmanoma aptikti antikūnų prieš ŽIV virusą, yra kultūra ir amplifikaciniai metodai su hibridizacija.